Script IV RT MasterMix ( for qPCR)反轉(zhuǎn)錄
Script IV RT MasterMix采用第四代高達(dá)60℃的全新高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，可以通讀GC含量豐富，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板，極大提高了逆轉(zhuǎn)錄效率，CT值一般提早2-3個(gè)循環(huán)。Script IV RT MasterMix ( for qPCR)反轉(zhuǎn)錄
Script IV RT MasterMix
( Perfect for qPCR )
Script IV RT MasterMix ( for qPCR)反轉(zhuǎn)錄
目錄號(hào):71618
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71618-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71618-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x RT Mix IV | 200μl | 400μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個(gè)月。
產(chǎn)品簡介
Script IV RT MasterMix采用第四代高達(dá)60℃的全新高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，可以通讀GC含量豐富，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板，極大提高了逆轉(zhuǎn)錄效率，CT值一般提早2-3個(gè)循環(huán)。
5x RT Mix IV為一管式逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，含有逆轉(zhuǎn)錄所需的所有試劑（Script IV Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dTPrimer、dNTP Mixture、RT Buffer），并且，針對(duì)qPCR進(jìn)行特別優(yōu)化oligodT和N6隨機(jī)引物配比，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始并具有相同的逆轉(zhuǎn)錄效率，zui大程度保證了qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。
適用范圍
第一鏈cDNA合成，尤其高GC含量，復(fù)雜模板的cDNA合成?？捎糜诟呖截悺⒌涂截惢虻臋z測(cè)。
注意事項(xiàng)
1． 避免RNase污染。
2． 為保證反轉(zhuǎn)錄成功，建議使用高質(zhì)量的RNA樣品。
3． 5x RT Mix IV含有甘油比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外，導(dǎo)致?lián)p失， 使用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后取用。 5x RT Mix IV包含的酶過量，即使每次分別按照3.8 μl使用，也不影響使用效果。
4． 20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系建議加入不超過1μg的Total RNA。如果目的基因的表達(dá)量非常低，最多加入5 μg Total RNA，否則，RNA量過高，可能會(huì)超出后續(xù)qPCR的線性范圍。
5． 本產(chǎn)品適用于包含Ploy (A)結(jié)構(gòu)的真核生物mRNA和不包含Ploy (A)結(jié)構(gòu)的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小RNA模板。
6． 如果模板具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，推薦使用變性步驟，即在操作步驟之前，將模板RNA在65℃孵育5 min后迅速轉(zhuǎn)移到冰上，再加RNA模板和RNase free H2O，混勻，50°C孵育15 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
重要提示：操作前，請(qǐng)將各組分輕彈混勻，點(diǎn)甩離心后置冰上備用。
1． 反應(yīng)體系的配制
于冰上，在PCR管中，加入以下組分：
Components | Volume |
Total RNA / mRNA | 50ng ~ 1μg / 5ng ~ 100ng |
5x RT Mix IV | 4 μl |
RNase-free H2O | To 20 μl |
2． 輕柔吸打混勻，50℃孵育15 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3． 85°C加熱5 sec，終止反應(yīng)。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用；長期存放，請(qǐng)分裝后存于-70°C。
qPCR
建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應(yīng)體系的模板。
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